(一)免疫熒光組織化學(xué)原理

    將已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受到激發(fā)光的照射會(huì)發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，熒光素受激發(fā)光照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子不穩(wěn)定，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時(shí)發(fā)出明亮的熒光。利用熒光顯微鏡可觀察熒光所在細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

(二)熒光抗體染色法

1．直接法

(1)染色：切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)的熒光抗體，在室溫或37℃染色30min。切片置入濕盒內(nèi)，防止干燥。

(2)洗片：倒去熒光抗體，將切片浸入pH 7．2磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗兩次，電磁"振動(dòng)，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。

(3)50％碳酸鹽緩沖甘油(O．5mol／L碳酸鹽緩沖液pH 9．O～9．5)封固、鏡檢。

直接法相對(duì)簡單，適用于細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗體如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)抗原，特異性高而敏感性相對(duì)低。

2．間接法(雙層法)

(1)切片固定后用毛細(xì)管吸取適當(dāng)稀釋的免疫血清滴在其上，置于濕盒中，37℃作用30min。用O．01mol／LpH 7．2 PBS洗滌兩次，每次5min，用濾紙吸去多余液體。

(2)再滴加問接熒光抗體(如兔抗人γ一球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，37℃染色30min，PBS洗滌兩次，每次5mirt，振動(dòng)，緩沖甘油封固，鏡檢。

3．間接法(夾心法)

(1)切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。

(2)滴加未標(biāo)記的特異性抗原與切片作用于37℃，30min。

(3)PBS緩沖液洗滌2次，每次5min，吹干。

(4)在切片上滴加特異性熒光抗體，37℃，30 min。

(5)PBS緩沖液洗滌兩次，每次5min，吹干。

(6)緩沖甘油封固，鏡檢。

4．補(bǔ)體方法

(1)材料和方法

1)免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers；鹽水作2倍稀釋，為1：2，1：4，1：8…補(bǔ)體用10倍稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合效價(jià)如為1：32，則免疫血清應(yīng)用l：8倍稀釋。

2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作l：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果，按兩單位的比例，用K。lmers鹽水稀釋備用。

Kolmers鹽水配制是在pH7．4的0．1mol／L PBS中溶解MgSO4，其終濃度為O．01％。

3)抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為兩單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolrners鹽水稀釋備用。

(2)方法

1)涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗滌一次，約3min，吹至組織表面無水分。

2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補(bǔ)體的等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都各稀釋一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于濕盒內(nèi)。

3)用PBS緩沖液洗滌2次，攪拌或振動(dòng)混勻，每次5m·n，吸于標(biāo)本周圍水分。

4)滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體，37℃作用30min，水洗同上。

5)蒸餾水洗滌lmin，緩沖甘油封固。

5．膜抗原熒光抗體染色法

用直接法或間接法原理及步驟，可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常于T和B細(xì)胞、細(xì)貔培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的研究，陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。

6．雙重染色方法

(1)一步法雙染色法：先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接方法進(jìn)行姿色。

(2)二步法雙染色方法：先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。

(3)結(jié)果：經(jīng)FITC標(biāo)記的A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，經(jīng)RB200標(biāo)記的B抗原陽性呈現(xiàn)橘紅色熒光。

(三)熒光抗原染色法

    某些抗原可用熒光素標(biāo)記，制成熒光抗原，標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同：用熒光抗原可直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法與熒光抗體染色的直接染色法相同。由于多數(shù)抗原難以提純或量少昂貴，一般很少采用此法。