淀粉磷酸化酶(SP)測試盒

淀粉磷酸化酶(SP)測試盒

商品詳情：
測定意義：

淀粉磷酸化酶(Starch Phosphorylase，SP)是淀粉代謝過程的可逆反應(yīng)酶，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解。

在高等植物中，淀粉磷酸化酶(合成方向)主要存在于質(zhì)體中，負(fù)責(zé)延長淀粉的 α-1,4-葡萄糖鏈的非還原末端；淀粉磷酸化酶(分解方向)主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，負(fù)責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解，是淀粉代謝過程中的關(guān)鍵酶。

在植物體中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無機(jī)磷濃度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸濃度幾乎高了兩個數(shù)量?茀?

測定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵與無機(jī)磷反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，并在6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下還原NADP+產(chǎn)生NADPH，使340nm下吸光值增加。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣品中AA提取：

1.按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行室溫勻漿，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2.細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.血清等液體：直接檢測。

計算公式如下：

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000萬。

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注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢。

2. 為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個樣做預(yù)實驗，如果測定的吸光值過高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 與茚三酮反應(yīng)在570nm處無吸收峰，因此，570nm處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4．檢出限為100μmol/L。